DNA가 조작되기 위해서는 DNA의 유전자 코드로부터 단백질이 생산될 수 있는 운송수단에 배치되어야 한다. 단백질 재조합 합성에 사용되는 가장 일반적인 숙주 세포로는 포유류 세포, 박테리아, 효모 세포, 곤충 세포가 있다.

재조합 단백질의 합성은 관심있는 유전자의 확인과 함께 시작된다. 이러한 유전자들을 자연 게놈으로부터 분리하기 위해 DNA는 핵산 중간 분해 효소로 알려진 제한 효소로 처리된다. 이 효소들은 복제 단계를 위해 준비하는 게놈에서 관심 있는 유전자를 잘라낸다.

복제는 관심있는 유전자를 발현 벡터에 삽입하고 발현하는 과정이다. 그러나 이 문제가 발생하기 전에 관심 조각을 증폭해야 합니다. 관심 있는 유전 물질이 후속 염기서열 분석 단계를 위해 충분한 양이어야 하기 때문에 이 단계가 필요하다. 이것은 종종 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 수행된다. PCR은 가장 일반적인 체외 복제 방법이다. 그러나 복제는 체내 환경에서도 수행될 수 있다. 가장 일반적인 체내 복제 방법은 박테리아 E 내에서 이루어진다.대장균.

증폭 후에 벡터는 숙주 세포에 도입되어야 한다. 벡터는 체내 환경에서 증폭이 수행되면 이미 숙주 세포에 있을 수 있다. 그러나 체외에서 복제를 수행할 경우 숙주 세포는 기계적(예: 전기자극, 미세주입) 또는 화학적(예: 인산칼슘, 열충격) 전달 방법을 통해 유전 물질의 흡수를 준비한다.

발현 유전자가 추가돼야 숙주가 상당량의 재조합 단백질을 생산한다. 단백질의 발현은 관심있는 DNA를 둘러싸고 있는 유전자에 달려있다. 이 유전자의 모음은 세포에 의해 관심 있는 DNA의 전사와 번역에 대한 지시를 제공하는 신호로 작용한다. 이러한 신호에는 촉진제, 리보솜 결합 부위 및 종단기가 포함된다.

벡터에 삽입된 DNA 조각은 종종 특정한 기능을 가진 다른 중요한 비암호화 영역을 가지고 있다. 이 지역들은 과학자들이 유전자가 발현될 수 있도록 할 뿐만 아니라 어떤 세포가 재조합 유전자 분자를 포함했는지 구별하게 해준다. 예를 들어, 항생제 내성 유전자는 숙주 세포가 항생제가 풍부한 배지에서 생존할 수 있도록 한다. 그 결과 벡터를 차지하지 않은 숙주 세포는 항생제에 대한 내성을 위해 필요한 유전자를 발현하지 못하여 그 유기체는 죽는다.

벡터는 종종 특정 DNA 염기서열 외에 꼬리표를 포함하며, 이는 재조합 단백질의 정화를 촉진한다. 이것은 종종 아미노산 서열의 N 말단에 첨가된다. 재조합 DNA 기술에 사용되는 가장 일반적인 태그 중 하나는 헥사히스티딘 태그(His-Tag)이다. 이것은 재조합 단백질 정화 및 발현을 위한 금속 결합 부위로 작용하는 6개의 히스티딘 잔기의 배열이다. His-Tag에는 특정 프로테아제를 위한 절단 부위가 포함되어 있다. HIS-Tag 재조합 단백질은 중금속 이온으로 사용되는 니켈 이온 기둥과 같은 금속 첼레이트 친화도 크로마토그래피에 의해 정제되고 HIS-Tag 단백질은 히스티딘 또는 이미다졸과 함께 금속 껍질 기둥에서 용출된다. 그런 다음 정제된 His-Tag 단백질을 특정 단백질 분해 효소로 처리하여 His-Tag을 제거하거나 제거하지 않는다.

결과물은 완전히 형성된 재조합 단백질이다. 증폭은 PCR 단계 동안뿐만 아니라 이 단계에서도 일어나는데, 숙주 세포는 벡터가 흡수되면 수천 개의 단백질을 생산할 수 있는 잠재력을 가지고 있기 때문이다.

재조합 단백질의 기능