Western blot은 가장 일반적으로 사용되는 실험기법이지만, 실험자에 따라 그 결과물의 차이가 큰 실험 중의 하나이다. 실험 과정 중 background의 원인이 되는 요소는 다양하지만 몇 가지로 정리해 보면 다음과 같다. 특히, 2차 항체의 희석 비율, washing step과 exposure step은 background 증가에 미치는 영향이 크므로 실험 조건을 최적화하는 것이 필요하다.

1. Blocking

1) Reagent: Skim milk, BSA, Gelatin 등이 사용되며, 그 중 5% skim milk가 가장 저렴하고 대부분의 경우에 좋은 결과를 보여 주므로 가장 널리 사용된다.

Blocking reagent의 종류는 특별한 경우를 제외하고는 결과에 크게 영향을 주지 않는 것으로 보이며, 개인적인 사용 경험이나 선호도에 따라 사용하는 종류가 다른 정도이다.

단, biotinylated antibody를 사용하는 경우 Skim milk나 BSA에 포함된 biotin에 Streptavidin의 binding site를 blocking하는 결과를 초래하므로 사용에 주의가 필요하다. 보다 중요한 것은 blocking reagent는 멸균 상태로 사용하지 않으므로 온도 조절이 잘 되지 않는 실험실이나 여름철에는 변질될 가능성이 있다.

변질된 유단백질은 membrane에 엉겨 붙어 background의 원인이 되는데, 이 경우 세포배양에 사용하는 항생제인 Penicillin/Streptomycin를 1x로 넣어 사용하거나, 0.1% sodium azide를 넣어 사용할 수 있다. 단, HRP가 결합된 secondary antibody의 경우, azide가 HRP의 저해제이므로 사용해서는 안 된다.

실험자에 따라 항체 반응시에는 첨가하지 않는 경우도 있는데, 항체 반응시에도 첨가하는 것이 background를 감소시키는 데 도움이 된다.

2) Blocking time: 실온에서 1시간, strip 후에는 30분 정도로 충분하다.

Blocking 시간이 부족해서 background가 증가하는 경우는 드물다.

3) Blocking temperature: 실온 (25도 정도)이 가장 일반적으로 사용되며, 경우에 따라 4도도 사용된다.

2. 1차항체

1) Specificity: 항체를 선택할 때는 datasheet에 실험 결과가 포함된 specificity가 검증된 제품을 사용한다.

이때 결과는 정제된 항원 단백질이 아닌 cell lysate에서 specific band가 확인된 제품을 선택한다.

항체의 source 는 샘플과 동일한 것을 피한다 (예, mouse sample 사용시 mouse monoclonal antibody: secondary 항체가 anti-mouse IgG가 되므로 혈액이 소량 포함된 조직 샘플의 경우 혈액의 IgG를 인식하여 background가 생김).

2) Dilution: 샘플의 양과 제품조사에 따라 달라질 수 있지만, 대부분의 1:1000을 많이 사용한다. 추천 희석비율에서 signal이 약할 경우 2배 정도 높게, 강할 경우 2배 정도 낮게 사용한다.

3) Incubation time: 4도에서 overnight (12~16 h)를 가장 많이 사용하며, 실온에서 ~2 h 정도도 사용된다. Background를 감소시키면서 signal의 강도를 증가시키기 위해서는 4도에서 O/N가 더 좋다.

4) Incubation temperature: Incubation 시간에 따라 4도 혹은 실온이 사용되며, 4도가 background 감소에 더 좋다.

3. 2차항체

1) Specificity: 1차 항체와 마찬가지로 specificity가 data로 잘 검증된 제품을 사용한다.

2) Dilution: 1:1,000~1:100,000까지 제조사별로 다양하다. 1:5,000~1:10,000 정도 제품이 무난하다. 제조사별로 비교적 잘 검증된 제품이 많고, 가격도 1차 항체에 비해 저렴하여 직접 titration으로 검증한 후 사용한다. Non-specific band나 membrane 전체를 검게 만드는 주요인이 secondary 항체의 잘못된 희석 비율과 불충분한 washing step으로 인한 경우가 가장 많다. 왜냐하면 발색효소인 HRP가 혹은 Alkaline phosphatase가 secondary에 결합되어 있기 때문이다. 따라서 이 step를 가장 주의 깊게 할 필요가 있다.

3) Incubation time: 일반적으로 실온에서 1~2시간이면 충분한데, detection하고자 하는 단백질의 양이 아주 소량일 경우에는 2차 항체와의 incubation 시간을 4도에서 O/N하는 경우가 도움이 된다.

4) Incubation temperature: 실온을 가장 많이 사용하며, 반응시간을 길게 하거나, 여름철처럼 실온이 높을 경우는 4도에서 진행할 수 있다.

4. Washing

2) Time: 1차 항체는 5분 x 4회, 2차 항체는 10분 x 4회 이상이 필요하다. 1차 항체는 너무 길게 씻어 주면 signal도 감소시키는 경우가 있으므로 적정 시간 동안만 반복한다.

2차 항체 반응 후 washing step은 background에 상당히 많은 영향을 주는 step이다.

따라서 샘플내의 다른 단백질이나 membrane에 nonspecific하게 결합된 2차 항체가 충분히 제거될 수 있게 반응시간과 횟수를 충분히 한다.

즉, 1차 항체 반응 후에 비해  반응시간은 10분, 횟수는 최소 4회가 필요하다.

이때 membrane 전체에 나타나는 background 증가에 영향을 주는 중요한 요소가 washing에 사용되는 용기의 종류이다. 용기 바닥이 완전히 평평한 경우 membrane이 붙어 washing이 효과적으로 일어나지 않는다. 세척 통의 바닥은 완전히 평평한 것보다는 제조시에 생긴 중앙에 범퍼처럼 올라온 용기를 사용하며 membrane이 바닥에 붙지 않고 뜨게 만들어 주어 도움이 된다.