·çÁ¨¿¡½º¾¾¾ÆÀÌ´Â °í°´¸¸Á·À» À§ÇØ ÃÖ¼±À» ´ÙÇÒ°ÍÀ» ¾à¼Óµå¸³´Ï´Ù.

We could promise we will do our best trials to meet customers' requests


Áú¹® Western blotting ¿ø¸®,¹æ¹ý western blot Á¤º¹Çϱâ
ÀÛ¼ºÀÚ lugensci
ÀÛ¼ºÀÏÀÚ 2023-01-19




 

1. Western blotting ¿ø¸®

Western blotÀº ¼¼Æ÷³ª Á¶Á÷¿¡¼­ ¾òÀº ´Ü¹éÁúµé¿¡¼­ ƯÁ¤ ´Ü¹éÁú (specific protein)À» °ËÃâÇÒ ¼ö ÀÖ´Â ½ÇÇè ¹æ¹ýÀÌ´Ù. ±âº» ¿ø¸®´Â ´Ü¹éÁúÀ» sizeº°·Î ºÐ·ùÇÑ µÚ¿¡ ¹ßÇö ¾çÀ» È®ÀÎÇÏ°í ½ÍÀº Ç×ü¸¦ ÀÌ¿ëÇÏ¿© È®ÀÎ ÇÏ´Â °ÍÀÌ´Ù. Áï, Ç׿ø-Ç×ü ¹ÝÀÀÀ» ÀÌ¿ëÇÑ ´Ü¹éÁúÀÇ ¹ßÇöÀ» È®ÀÎÇÒ ¼ö ÀÖ´Â ½ÇÇè ¹æ¹ýÀÌ´Ù. ±×·¸´Ù¸é °¢ workflow º°·Î Á» ´õ ÀÚ¼¼È÷ ¾Ë¾Æº¸µµ·Ï ÇÏ°Ú´Ù.

Àü±â¿µµ¿¿¡ ¿µÇâÀ» ÁÖ´Â ¿äÀεéÀº ¼¼ °¡Áö°¡ ÀÖ´Ù.

  1. ´Ü¹éÁúÀÇ Å©±â Áï, sizeÀÌ´Ù. ´Ü¹éÁúÀÇ Å©±â°¡ Ŭ¼ö·Ï polyacrylamide gelÀ» Åë°úÇÏ´Â ¼Óµµ°¡ ´Ê¾îÁö°Ô µÇ°í À§ÂÊ¿¡ ³²°Ô µÈ´Ù.
  2. ´Ü¹éÁúÀÌ °®´Â ÀüÇÏ (charge)°¡ ¿µÇâÀ» ÁØ´Ù. Àü±â ¿µµ¿Àº ¸» ±×´ë·Î Àü±â·Î ¹°ÁúÀ» ¿òÁ÷ÀÌ°Ô ÇÏ´Â °ÍÀ̱⠶§¹®¿¡ ´Ü¹éÁú ÀÚü°¡ ÀüÇϸ¦ ¶ç°Ô µÇ¸é Àü±â ¿µµ¿µÇ´Â ¼Óµµ°¡ ´Þ¶óÁø´Ù.
  3. ´Ü¹éÁúÀÇ ±¸Á¶ ¶ÇÇÑ Àü±â ¿µµ¿¿¡ ¿µÇâÀ» ÁØ´Ù. »çÀÌÁî´Â °°À¸³ª ÀÛ°Ô ¹¶ÃÄÁ® ÀÖ´Â ´Ü¹éÁú A¿Í Å©°Ô ÆÛÁ® ÀÖ´Â ´Ü¹éÁú B°¡ ÀÖ´Ù. ´ç¿¬È÷ ÀÛ°Ô ¹¶ÃÄÁ® ÀÖ´Â ´Ü¹éÁúA°¡ Å©°Ô ÆÛÁ®ÀÖ´Â ´Ü¹éÁú Bº¸´Ù ÈξÀ Àß ¿òÁ÷ÀÏ ¼ö ÀÖ´Ù.

Western blotÀÇ ¸ñÀûÀº sizeº°·Î ´Ü¹éÁúÀ» ºÐ·ùÇÏ°í western blotting ¿ø¸®ÀÎ Ç׿ø Ç×ü ¹ÝÀÀÀ» ÀÌ¿ëÇÏ¿© target ´Ü¹éÁúÀ» °ËÃâÇÏ´Â °ÍÀÌ ¸ñÀûÀÌ´Ù. ´Ù½Ã ¸»Çϸé, ´Ü¹éÁúÀÇ ÀüÇÏ¿Í ±¸Á¶¶ó´Â º¯¼ö´Â Á¦°Å ÇØ¾ß ÇÑ´Ù´Â °ÍÀÌ´Ù. ±× ¹æ¹ý¿¡ ´ëÇؼ­ ¾Ë¾Æº¸ÀÚ.

1) ´Ü¹éÁúÀÇ ÀüÇÏ – Western blot¿¡¼­ SDSÀÇ ¿ªÇÒ

Western blotting ¿ø¸®´Â Ç׿ø Ç×ü ¹ÝÀÀÀÌÁö¸¸ ¾Æ¹«·¸°Ô³ª Ç×ü¸¦ ¹ÝÀÀ ½ÃÅ°´Â °ÍÀÌ ¾Æ´Ï´Ù. Western blotting ¼öÇàÇϱâ À§Çؼ­ sampleÀ» ÁغñÇÏ´Â °úÁ¤À» °ÅÃÄ¾ß ÇÑ´Ù. ÀÌ step¿¡¼­ ±²ÀåÈ÷ Áß¿äÇÑ ¿ªÇÒÀ» ÇÏ´Â °ÍÀÌ sodium dodecyl sulfate (SDS) ÀÌ´Ù. SDS´Â detergent·Î ¼¼Æ÷¸·À» ³ì¿© ´Ü¹éÁúÀÌ ¹ÛÀ¸·Î ³ª¿Ã¼ö ÀÖ°Ô ÇÒ »Ó¸¸ ¾Æ´Ï¶ó ´Ü¹éÁúÀ» coatingÇÏ¿© negative charge·Î ¹Ù²Ù¾î ÁØ´Ù. À§¿¡¼­ ¸»ÇßµíÀÌ ÀüÇÏ´Â Àü±â¿µµ¿ÀÇ ¼Óµµ¿¡ ¿µÇâÀ» ÁÙ ¼ö ÀÖ´Ù. ÇÏÁö¸¸, SDS°¡ ¸ðµÎ À½ÀüÇÏ·Î ¹Ù²Ù¾î ÁÖ¾ú±â ¶§¹®¿¡ ÀüÇ϶ó´Â º¯¼ö¸¦ ¾ø¿¡°í ¿ÀÁ÷ size·Î¸¸ ºÐ·ù°¡ °¡´ÉÇÏ°Ô ÇÏ´Â °ÍÀÌ´Ù.

2) ´Ü¹éÁúÀÇ ±¸Á¶ – Western blot ¥â-mercaptoethanolÀÇ ¿ªÇÒ

ÀÌ¿Ü¿¡µµ °í·ÁÇØ¾ß ÇÒ °ÍÀÌ ¹Ù·Î ´Ü¹éÁúÀÇ ±¸Á¶ÀÌ´Ù. ´Ü¹éÁúÀº 2Â÷ ±¸Á¶, 3Â÷ ±¸Á¶¸¦ Çü¼ºÇÏ°í À־ »çÀÌÁî°¡ °°´Ù°í ÇÏ´õ¶ó°í ¾î¶°ÇÑ ÇüŸ¦ ¶ç°í Àִ°¡¿¡ µû¶ó¼­ Àü±â ¿µµ¿¿¡¼­ ´Ù¸£°Ô ºÐ·ùµÉ ¼ö ÀÖ´Ù. À§¿¡¼­µµ ¸»ÇßµíÀÌ ´Ü¹éÁúÀÇ size´Â °°À¸³ª ÀÛ°Ô ¹¶ÃÄÁ® ÀÖ´Â ´Ü¹éÁú°ú ³Ð°Ô ÆÛÁ®ÀÖ´Â ´Ü¹éÁúÀº Àü±â ¿µµ¿ ÇÒ ¶§ Àü±â¿¡ ÀÇÇØ ¿òÁ÷ÀÌ´Â ¼Óµµ°¡ ´Þ¶óÁö°Ô µÈ´Ù. ±×·¡¼­ ¸ðµÎ °°Àº ±¸Á¶·Î ¸¸µé¾îÁÖ±â À§Çؼ­ linear ÇüÅ·Π¸¸µé¾îÁÖ°Ô µÈ´Ù. linear ±¸Á¶·Î ¸¸µå´Â °ÍÀÌ ¥â-mercaptoethanolÀÌ´Ù. ¥â-mercaptoethanolÀº ÀÌȲȭ °áÇÕ (disulfide bond)¸¦ ²÷¾î ÁÖ¾î ´Ü¹éÁúÀÌ Çü¼ºÇÏ°í ÀÖ´Â ±¸Á¶¸¦ linear ÇüÅ·Π¹Ù²Ù´Â ¿ªÇÒÀ» ÇÑ´Ù.

2. Sodium dodecyl sulfate – Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

Sampling °úÁ¤À» °ÅÃļ­ ÁغñµÈ ´Ü¹éÁú ½Ã·á¸¦ SDS-PAGE gel¿¡ loading ÇÏ°í Àü±â¸¦ °É¾îÁÖ¾î sizeº°·Î ºÐ·ùÇÏ´Â °úÁ¤ÀÌ´Ù. polyacrylamide gelÀÌ ´Ü¹éÁúÀ» sizeº°·Î ºÐ·ùÇϱâ ÁÁÀº ÀÌÀ¯´Â ´ÙÀ½°ú °°´Ù.

  1. Àü±âÀûÀ¸·Î Áß¼ºÀÌ´Ù.
  2. Ä£¼ö¼ºÀÌ´Ù.
  3. SDS-PAGE¿¡ »ç¿ëµÇ´Â buffer¿Í ¹ÝÀÀÇÏÁö ¾Ê´Â´Ù.
  4. ´Ü¹éÁú°ú °áÇÕ·ÂÀÌ ¸Å¿ì ³·´Ù.

Á¤¸®ÇÏÀÚ¸é ´Ü¹éÁúÀ» size¸¸À» °í·ÁÇÏ¿© ºÐ·ùÇÒ ¼ö ÀÖ´Â gelÀ̶ó°í »ý°¢ÇÏ¸é µÈ´Ù.

3. Polyacrylamide gel (PAGE)

Polyacrylamide gelÀº bis-acrylamdie¿¡ ammonium persulfate (APS)¿Í tetramethylethylenediamine (TEMED)¸¦ ³Ö¾îÁÖ¸é polymerization ½ÃÀ۵Ǹç, ÀÌ ¼Óµµ´Â ¿Âµµ¿Í ³óµµ¿¡ µû¶ó ´Ù¸£´Ù. Western blot¿¡¼­´Â ÁÖ·Î 8~15%ÀÇ gelÀÌ »ç¿ëµÇ´Âµ¥ % ³óµµ°¡ ³ôÀ»¼ö·Ï ÀÛÀº sizeÀÇ ´Ü¹éÁúÀ» ºÐ·ùÇϴµ¥ À¯¸®ÇÏ¸ç ¹Ý´ë·Î % ³óµµ°¡ ³·À» ¼ö·Ï Å« ´Ü¹éÁúÀ» ºÐ¸®Çϴµ¥ ¿ëÀÌÇÏ´Ù. .

Stacking gel ¿ø¸® & Separating gel ¿ø¸®

Stacking gelÀº loading µÈ sampleµéÀ» ÇÑ ÁÙ·Î Á¤·ÄÇÏ°Ô ¸¸µå´Â gelÀÌ´Ù. Áï, Ãâ¹ß¼±À» ¸ÂÃß¾î ÁØ´Ù°í »ý°¢ÇÏ¸é µÈ´Ù. º¸Åë 4%ÀÇ ³·Àº ³óµµ·Î ¸¸µé°Ô µÇ¸ç pH°¡ 6.8·Î sperating gel (pH8.8) ¿¡ ºñÇØ ³·´Ù. ÀÌ pH°¡ ´Ü¹éÁúÀ» Á¤·ÄÇÏ°Ô ¸¸µå´Â °áÁ¤ÀûÀÎ ¿äÀÎÀÌ´Ù. pH°¡ 6.8¿¡¼­´Â °¢ ¹°ÁúµéÀÇ À̵¿ ¼Óµµ°¡ ´ÙÀ½°ú °°´Ù.

Cl > protein > Glycine (PI=6.2)

Áï, ´Ü¹éÁúÀÇ À̵¿ ¼Óµµ°¡ ¿°¼Ò À̿°ú glycine »çÀÌ¿¡ À§Ä¡ÇÏ°Ô µÇ¹Ç·Î ´Ü¹éÁúµéÀÌ ÀÏÁ÷¼±À¸·Î Á¤·ÄµÇ°Ô µÈ´Ù. ÇÏÁö¸¸, ÀÌ ¹°ÁúµéÀÌ pH°¡ 8.8ÀÎ saperating gel¿¡ µµ´ÞÇÏ°Ô µÇ¸é À̵¿ ¼Óµµ°¡ ´ÙÀ½°ú °°ÀÌ º¯È­µÈ´Ù.

Cl > Glycine(PI=6.2) > Protein

±×·¯¹Ç·Î, sperating gel¿¡¼­´Â ´Ü¹éÁúÀÇ sizeº°·Î ºÐ·ù°¡ °¡´ÉÇÏ°Ô µÈ´Ù.


 



 

4. Transfer (Membrane) ¿ø¸®

ÀÌ·¸°Ô ºÐ·ù°¡ µÈ ´Ü¹éÁúµéÀº blotting membraneÀ¸·Î transfer ½ÃÄÑÁØ´Ù.  Polyvinylidene difluoride (PVDF) ¿Í nitrocellulose (NC) membraneÀÌ ÁÖ·Î »ç¿ëµÈ´Ù. °¢ membrane º° Ư¼ºÀº ¾Æ·¡ÀÇ Ç¥¿Í °°´Ù.

Binding capacity Sensitivity Background noise
PVDF membrane 170 ~ 200 ¥ìg/cm2 High High
NC membrane 80 ~ 100 ¥ìg/cm2 Low Low

PVDF membrane¿¡ ´Ü¹éÁúµéÀÌ ´õ Àß ´Þ¶óºÙÀ» ¼ö ÀÖÀ¸¹Ç·Î ÀûÀº ¾çÀÇ ´Ü¹éÁúÀ» °ËÃâÇϱ⿡´Â PVDF membraneÀÌ ´õ ÁÁ´Ù. ÇÏÁö¸¸ ±×¸¸Å­ ¹Î°¨µµ°¡ ³ô±â ¶§¹®¿¡ background°¡ ÁöÀúºÐÇÏ´Ù. NC membraneÀº ¹Ý´ë¶ó°í »ý°¢ÇÏ¸é µÈ´Ù. ´Ü¹éÁúµéÀÌ ´Þ¶óºÙ´Â ´É·ÂÀº Á» ¶³¾îÁö´õ¶óµµ background°¡ ±ú²ýÇÏ´Ù´Â ÀåÁ¡ÀÌ ÀÖ´Ù.

MembraneÀÇ pore sizeµµ °í·Á ÇØ¾ß Çϴµ¥ º¸Åë 0.1, 0.2 or 0.45¥ìmÀÌ ¾²ÀδÙ. 0.45¥ìm¸¦ ÀϹÝÀûÀ» »ç¿ëÇϸç 15KD±îÁö´Â »ç¿ëÇصµ ¹«¹æÇÏ´Ù. ÇÏÁö¸¸ ±× º¸´Ù ÀÛÀº »çÀÌÁîÀÇ ´Ü¹éÁúÀ» detectionÇÏ°íÀÚ ÇÑ´Ù¸é pore size¸¦ ´õ ÀÛÀº °ÍÀ» »ç¿ë ÇÏ´Â °ÍÀÌ ÁÁ´Ù.

5. Western blot blocking ¿ø¸®

BlockingÀº non-specific binding Áï, ºñ ƯÀÌÀûÀÎ °áÇÕÀ» ÁÙÀ̱â À§Çؼ­ ¼öÇàÇÏ´Â stepÀÌ´Ù. Blocking¿¡´Â ÁÖ·Î BSA³ª Skim milk°¡ ÁÖ·Î »ç¿ëµÇ¸ç ÀÌ´Â membraneÀÇ ºó °ø°£ µîÀ» blocking ÇÔÀ¸·Î½á ºñ ƯÀÌÀûÀÎ ¹ÝÀÀÀ» ÁÙ¿© ¿øÇÏ´Â target¿¡ Ç×ü°¡ ´õ Àß ºÙ°Ô ÇÏ´Â È¿°ú°¡ ÀÖ´Ù.

6. Detection ¿ø¸®

´Ü¹éÁúÀ» ÀÌ membraneµé·Î transferÇØ ÁØ µÚ¿¡ °ËÃâÇÏ°íÀÚ ÇÏ´Â ´Ü¹éÁúÀÇ primary antibody¸¦ ºÙ¿©ÁØ´Ù. ±× ÈÄ¿¡ ºñ ƯÀÌÀûÀÎ ¹ÝÀÀÀ» Á¦°ÅÇϱâ À§Çؼ­ wahsingÀ» ÇØÁØ µÚ secondary antibody¸¦ ºÙ¿©ÁØ´Ù. Secondary antibody¿¡´Â Horseradish Peroxidas (HRP)°¡ ºÙ¾îÀֱ⠶§¹®¿¡ substrate·Î ³Ö¾îÁÖ¾úÀ» ¶§ ºûÀ» ¹ß»êÇÏ°Ô µÇ°í À̸¦ filmÀ̳ª ±â°è·Î detection ÇÒ ¼ö ÀÖ´Ù.


 



 

Western blot protocolÀº Å©°Ô Sample preparation, Gel running, Transfer, Blocking, Antibody incubation, DetectionÀÌ·¸°Ô 6°¡Áö·Î ±¸¼ºµÇ¾î ÀÖ´Ù. °¢°¢ stepº°·Î ½ÇÇè¹æ¹ý°ú ÁÖÀÇ»çÇ×À» ¾Ë¾Æº¸°Ú´Ù.

1. Sample Preparation

  1. Culture dish¿¡¼­ Cell harvestÇÏ¿© EP tube·Î ¿Å±ä ÈÄ PBS¸¦ ÀÌ¿ëÇÏ¿© washing ÇÏ¿© cell pelletÀ» ¾ò´Â´Ù.
  2. Cell pelletÀ» RIPA buffer·Î lysis ÇÑ´Ù. BufferÀÇ ¾çÀº cellÀÇ ¾ç°ú Á¾·ù¿¡ µû¶ó ´Ù¸£Áö¸¸ ´ë·« 1 X 106 °³ÀÇ cell¿¡ ¾à 100µlÀÇ lysis buffer¸¦ ³Ö´Â´Ù. pipetÀ» ÀÌ¿ëÇÏ¿© Àß ¼¯¾îÁØ µÚ °¡º±°Ô voltexingÇÏ¿© Ice¿¡¼­ 15~30min °¡·® incubation ½ÃŲ´Ù.
  3. ¿ø½É ºÐ¸®ÇÏ¿© cell debris¸¦ °¡¶ó¾ÉÈù´Ù. (14,000 rpm (16,000xg), 15 min, 4¡ÆC)
  4. »óÃþ¾×¸¸ »õ Æ©ºê·Î ¿Å±ä´Ù.  
  5. Sample buffer¿Í Àß ¼¯Àº µÚ 5min Á¤µµ ²ú´Â ¹°¿¡ ÁßÅÁ ¶Ç´Â heat blockÀ» ÀÌ¿ëÇÏ¿© °¡¿­ÇÑ´Ù. ice ¿¡¼­ 5ºÐ °£ ½ÄÈù µÚ spin down ÇÏ¿© ¾×È­µÇ¾î Ç¥¸é¿¡ ¸ÎÈù ¾×üµéÀ» ¸ð¾ÆÁØ´Ù.

2. SDS-PAGE (gel running)

  1. SampleÀÌ ÁغñµÇ´Â µ¿¾È gelÀ» pre-running ÇØÁØ´Ù (10 min).
  2. pre-runningÇÑ gel ¿¡ sampleÀ» loading ÇÑ´Ù. GelÀ» Á÷Á¢ ¸¸µé¾î stacking gelÀÌ ÀÖ´Â °æ¿ì¿¡´Â 100 V ·Î stacking gel ±îÁö ³»·ÁÁØ ÈÄ 200V·Î ¿Ã·Á sperating gel¿¡¼­ »ùÇÃÀ» runningÇÑ´Ù (GelÀ» ±¸¸ÅÇÏ¿© »ç¿ëÇÏ´Â °æ¿ì Á¦Á¶»çÀÇ instructionÀ» µû¸£¸é µÈ´Ù.)
  3. È®ÀÎÇÏ°íÀÚ ÇÏ´Â ´Ü¹éÁúÀÇ Å©±â¿¡ µû¶ó¼­ gelÀÇ %¸¦ °áÁ¤ÇÑ´Ù. Àý´ëÀûÀÎ °ÍÀº ¾Æ´Ï³ª ´ÙÀ½À» Âü°íÇÏ¸é µÈ´Ù. (4-5% gel, > 200 kD; 7.5% gel, 120-200 kD; 8-10% gel, 40-120 kD; 13% gel, 15-40 kD; 15% gel, < 20 kD)


3. Transfer

Transfer´Â ¾î¶² Á¦Á¶»çÀÇ Á¦Ç°À» »ç¿ë ÇÏ´À³Ä¿¡ µû¶ó¼­ Ä«¼¼Æ®ÀÇ Á¶¸³ ¹æ¹ýÀÌ ´Ù¸£´Ù. ÇÏÁö¸¸ °øÅëÀûÀÎ °ÍÀº Àü·ù´Â (-) ¿¡¼­ (+) ·Î È帣¸ç, samplingÀÌ ³¡³­ ´Ü¹éÁúÀº SDS¿¡ ÀÇÇØ coatingµÇ¾î À½ÀüÇϸ¦ ¶ç°í ÀÖ´Ù. Áï (-)¿¡¼­ (+) ¹æÇâÀ¸·Î À̵¿ÇÏ°Ô µÇ¾î ÀÖ´Ù. ±×·¯¹Ç·Î, (-) ÂÊ¿¡ GelÀÌ (+)¿¡ membraneÀÌ ÀÖÀ¸¸é µÈ´Ù. Transfer time ¿ª½Ã ¾î´À Á¦Á¶»çÀÇ transfer tank¸¦ »ç¿ë ÇÏ´ÂÁö¿¡ µû¶ó¼­ ±× ½Ã°£°ú Á¶°ÇÀÌ ´Ù¸£´Ù. Á¦Á¶»çÀÇ instructionÀ» µû¸£´Â °ÍÀ» ÃßõÇÑ´Ù. ´Ù¸¸ transfer¿¡¼­´Â ¿­ÀÌ ¸¹ÀÌ ¹ß»ýÇϹǷΠcold roomÀ̳ª tank¸¦ ice¾È¿¡ ³Ö°í ÇÏ´Â °ÍÀ» ÃßõÇÑ´Ù. Transfer buffer ¿ª½Ã ¹Ì¸® Â÷°©°Ô ÇÏ¿© »ç¿ëÇÏ´Â °ÍÀÌ ÁÁ´Ù.

¸¹ÀÌ »ç¿ëÇÏ´Â transfer module maunal


4. Membrane Blocking

3~5%ÀÇ BSA³ª skim milk¸¦ »ç¿ëÇÑ´Ù. TBST¿¡ ³ì¿© »ç¿ëÇÏ¸é µÈ´Ù. MembraneÀÌ Àá±æ Á¤µµ¸é ÃæºÐÇÏ¸ç »ó¿Â¿¡¼­ 1 h Á¤µµ aggitation Çϸç blockingÇÑ´Ù.


5. Primary Antibody Incubation

AntibodyÀÇ dilutionÀº ¾î¶² antibody¸¦ »ç¿ë ÇÏ´À³Ä¿¡ µû¶ó¼­ ´Ù¸£´Ù. Á¦Á¶»çÀÇ instructionÀ» µû¸£´Â °ÍÀ» ÃßõÇÑ´Ù. ÇÏÁö¸¸ antibodyÀÇ °æ¿ì ¿ö³« °í°¡À̹ǷΠÁ» ´õ dilutionÇÏ¿© »ç¿ëÇϱ⵵ ÇÑ´Ù. Skim milk¸¦ TBST¿¡ ³ìÀÎ buffer¿¡ antibody¸¦ dilutionÇÏ¿© »ç¿ëÇÏ´Â °ÍÀÌ ÁÁ´Ù. ¸¸¾à Àç »ç¿ëÀ» ÇÒ °èȹÀÌ ÀÖ´Ù¸é skim milk´Â »ç¿ëÇÏÁö ¾Ê´Â °ÍÀÌ ÁÁÀ¸¸ç sodium azide¸¦ Ãß°¡ÇÏ¿© »ç¿ëÇÏ´Â °ÍÀÌ ÁÁ´Ù. ´Ù¸¸ sodium azide¸¦ Ãß°¡ÇÏ´Â °æ¿ì antibodyÀÇ È°¼ºÀÌ °¨¼ÒÇÏ´Â °æ¿ìµµ ÀÖÀ¸¹Ç·Î ÁÖÀÇÇÑ´Ù. 4¡ÆC ¿¡¼­ aggitation Çϸ鼭 overnightÀ¸·Î ¹ÝÀÀ½ÃŲ´Ù.


6. Washing & Secondary antibody incubation

  1. 10ºÐ¾¿ 3~5ȸÁ¤µµ TBST·Î washingÇÑ´Ù.
  2. WashingÀÌ ³¡³­ µÚ secondary antibody¸¦ dilution ÇÏ¿© »ó¿Â¿¡¼­ 1 ~ 2 h Á¤µµ ¹ÝÀÀ½ÃŲ´Ù.
  3. ¹ÝÀÀÀÌ ³¡³­ µÚ TBST·Î 10 ºÐ¾¿ 3~5ȸ Á¤µµ washing ÇÑ ÈÄ detection ÇÑ´Ù.

Western blot buffer¿¡ ´ëÇؼ­ ¾Ë¾Æº¸µµ·Ï ÇÏ°Ú´Ù. ÇÊ¿äÇÑ bufferµéÀÇ Á¾·ù¿¡´Â lysis buffer, sample loading buffer, running buffer, transfer buffer, blocking buffer, washing buffer µîÀÌ ÀÖ´Ù.

1. Lysis buffer

 ionic detergentÀÎ sodium deoxycholate (SDC)°¡ Æ÷ÇԵǾî ÀÖ°í ÀϹÝÀûÀ¸·Î western blot¿¡¼­ ¸¹ÀÌ »ç¿ëµÇ´Â bufferÀÌ´Ù. °­ÇÑ detergentÀÎ SDS¿Í SDC°¡ Æ÷ÇԵǾî ÀÖ¾î ÇÙ±îÁöµµ ¸ðµÎ lysisÇÒ ¼ö ÀÖ´Ù. ÀûÀº background¸¦ °®´Â´Ù´Â ÀåÁ¡ÀÌ ÀÖÁö¸¸ kinase³ª protein-protein interaction µîÀ» ¹æÇØÇÒ ¼ö À־ IP³ª pull-down assay¿¡¼­´Â Àß »ç¿ëµÇÁö ¾Ê´Â´Ù.

– RIPA buffer Á¶¼º (³óµµ´Â working ³óµµ)

  • 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)
  • 150 mM NaCl
  • 1% IGEPAL CA-630 or NP-40
  • 0.5% sodium deoxycholate
  • ​0.1% SDS
  • 1X Protease inhibitor cocktail

​2. Loading, running, transfer, and blocking buffers

1) Sample loading buffer

ÀÌ bufferÀÇ Á¶¼ºÀº µü Á¤ÇØÁ® ÀÖ´Â °ÍÀº ¾Æ´Ï´Ù. Sample loading bufferÀÇ Á¶¼ºÀº ¸Å¿ì ´Ù¾çÇϸç lab¸¶´Ù Á¶±Ý¾¿ ´Ù¸£´Ù. ÇÏÁö¸¸ ÇÙ½ÉÀûÀÎ ¿ªÇÒÀ» ÇÏ´Â buffer´Â ¸ðµÎ °øÅëÀûÀ¸·Î µé¾îÀÖÀ¸¸ç ±× ³óµµ¸¸ Á¶±Ý¾¿ ´Ù¸£´Ù. ÀÌ Sample buffer´Â sampling °úÁ¤¿¡¼­ °¡ÇØÁö´Â °í¿ÂÀÇ ¿­·ÎºÎÅÍ proteinÀ» º¸È£ÇÒ »Ó¸¸ ¾Æ´Ï¶ó pHÀÇ º¯È­µµ ÃÖ¼ÒÈ­ ÇÏ´Â ¿ªÇÒÀ» ¼öÇàÇÑ´Ù. ¶ÇÇÑ, ¥â-mercaptoethanolÀÇ ¿ªÇÒÀº ÀÌȲȭ°áÇÕ (disulfide bond)¸¦ ²÷¾î ÁÖ¾î ¸ðµç ´Ü¹éÁúÀ» linear formÀ¸·Î ¹Ù²Ù¾îÁØ´Ù. SDS ¿ªÇÒ ¿ª½Ã ´Ü¹éÁúÀÇ linear form¿¡ °ü¿©ÇÏ¸ç ´Ü¹éÁúÀÇ charge¸¦ netagive charge·Î ¹Ù²Ù¾î ÁÖ´Â ¿ªÇÒÀ» ¼öÇàÇÑ´Ù. GlycerolÀÇ ¿ªÇÒÀº sampleÀÇ ¹Ðµµ¸¦ Áõ°¡½ÃÄÑ ¾Æ·¡·Î °¡¶ó¾É°Ô ¸¸µå´Â ¿ªÇÒÀ» ¼öÇàÇϸç ÀÌ¿Ü¿¡µµ ´Ü¹éÁú ¾ÈÁ¤È­¿¡ ÀÛ¿ëÇÑ´Ù.

– Sample buffer Á¶¼º

  • 250 mM TrisHCl (pH6.8) – ¿ÏÃæÈ¿°ú
  • 10% SDS – ´Ü¹éÁúÀÇ negative charge, linear form À¯Áö
  • 30% Glycerol – sampleÀÇ ¹ÐµµÁõ°¡, ´Ü¹éÁú ¾ÈÁ¤È­
  • 5% ¥â-mercapitalethanol (or 0.5M DTT) – Disulfide bond Á¦°Å, linear form¿¡ °ü¿©
  • 0.02% bromophenol blue – Sample À§Ä¡ È®ÀÎ

2) SDS running buffer (Tris-Glysine)

SDS runnng buffer´Â Àü±â¿µµ¿°£¿¡ proteinÀ» linear formÀ¸·Î À¯Áö½ÃÄÑ sizeº°·Î ºÐ·ù½Ãų ¼ö ÀÖµµ·Ï ȯ°æÀ» Á¶¼ºÇØÁÖ´Â bufferÀÌ´Ù.

– 1X SDS running buffer Á¶¼º (º¸Åë 10X·Î ¸¸µé¾î º¸°ü)

  • 25 mM Tris base
  • 190 mM glycine
  •  0.1% SDS
  • Check the pH and adjust to 8.3

3) Transfer buffer (wet)

Transfer buffer´Â transfer Áß¿¡ membrane¿¡ proteinÀÌ Àß ÈíÂøµÇµµ·Ï ȯ°æÀ» Á¶¼ºÇØÁÖ´Â bufferÀÌ´Ù. MethanolÀ̳ª isopropanolÀ» ³Ö¾îÁÖ´Â ÀÌÀ¯´Â SDS¸¦ Á¦°ÅÇÏ¿© membrane¿¡ proteinÀÌ Àß ÈíÂøµÇ°Ô Çϱâ À§ÇÔÀÌ´Ù.

– 1X transfer buffer Á¶¼º (10X·Î ¸¸µé¾î º¸°ü, methanol or isopropanolÀº »ç¿ë Á÷Àü¿¡ ³Ö¾îÁÜ)

  • 25 mM Tris base
  • 190 mM glycine
  • Adjust pH 8.3
  • 10% methanol or isopropanol

4) Blocking buffer

MembraneÀÇ ºó °ø°£À» blockingÇÏ¿© non-specific bindingÀ» ÁÙ¿©ÁÖ´Â bufferÀÌ´Ù.

  • 3–5% milk or BSA (bovine serum albumin)
  • Dissolve in TBST buffer

3. Washing buffer

10x TBS buffer Á¶¼º (Tris-buffered saline)

º¸Åë 10X·Î ¸¸µé¾î º¸°üÇÑ´Ù (1X »ç¿ë½Ã D.W 900ml + 10X TBS 100 ml).

  • 1500 mM NaCl
  • 500 mM Tris-HCl
  • Adjust pH 7.6

1X TBST buffer Á¶¼º (1L ±âÁØ)

  • 10X TBS: 100ml
  • Tween-20: 1ml
  • Distilled water: 899ml

4. Stripping buffer

Membrane¿¡ antibody¸¦ ºÙÀÌ°í detectionÀ» ÇÑ µÚ ´Ù¸¥ antibody¸¦ ºÙÀÌ°í ½ÍÀ»¶§ »ç¿ëÇÏ´Â bufferÀÌ´Ù. Membrane¿¡ ºÙÀº antibodyµéÀ» Á¦°ÅÇϴµ¥ »ç¿ëµÈ´Ù. »ç¿ë ÈÄ¿¡´Â TBST·Î ÃæºÐÈ÷ wahsingÀ» ÇØ¾ß ´ÙÀ½ antibody°¡ ºÙ´Âµ¥ ÁöÀåÀÌ ¾ø´Ù.


Stripping buffer Á¶¼º (100ml ±âÁØ)

  • 10% SDS: 20 mL
  • 0.5 M Tris HCl (pH 6.8): 12.5 mL
  • Distilled water: 67.5 mL
  • ​Add 0.8 mL ¥â-mercaptoethanol under the fume hood


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 

(Ãâóhttps://bio-chae.com/)

¸Þ´º´Ý±â

°ßÀû¹®ÀÇ

INQUIRY

¾Æ·¡ Ç׸ñ¿¡ ¸Â°Ô Á¤È®È÷ ÀÔ·ÂÇÏ¿© ÁֽʽÿÀ.